Công nghệ chuyển gen ở thực vật bậc cao

Chuyên đề: CÔNG NGHỆ CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT BẬC CAO
 Giáo viên: Trần Thị lành
 Tổ Sinh - KTNN
 PHẦN I: CƠ SỞ KHOA HỌC CHO QUÁ TRÌNH CHUYỂN GEN
 I. Đặc điểm bộ máy di truyền tế bào thực vật:
 Các tính trạng của thực vật là biểu hiện của các gen di truyền . Có các tính trạng đơn 
gen (do 1 gen phụ trách) có những tính trạng đa gen( do tác động phối hợp của nhiều gen)
 Về mặt hóa học, gen là 1 dãy nucleotit có số nucleotit và dãy mã tự đặc trưng, số 
nucleotit cấu tạo nên 1 gen, thường biểu thị theo KG (Kilobase = 1000 nucleotit). Biểu hiện 
trực tiếp hoạt động của gen là các protein này là các E, nhờ vậy quá trình trao đổi chất, sinh 
trưởng, phát triển . của thực vật được thực hiện theo 1 chương trình xác định trong thông 
tin di truyền đặc trưng cho loài.
 Tế bào thực vật khác xa với tế bào động vật và vi sinh vật:
 I.1.Tế bào thực vật là một tế bào hữu nhân điển hình:
 Tế bào thực vật có cellulose bao bọc bên ngoài màng nguyên sinh. cellulose của các tế 
bào thực vật liên kết nhau bằng peclin và các dẫn xuất cellulose khác.
 Vai trò của cellulose ở chỗ bảo vệ và giúp cho thực vật đứng thẳng mà còn giúp cho 
toàn bộ quá trình trao đổi chất.
 Nếu xử lý mô thực vật bằng enzim peclinaza và celluloza, phần lớn peclin và celluloza 
bị phân hủy, các tế bào thực vật trần không có vỏ celluloza bao bọc được giải phóng ra môi 
trường được gọi là protoplast. Protoplast có thể được nuôi sống và tái tạo lại thành tế bào, 
mô hay cây hoàn chỉnh. Trong bất kì môi trường nào hoạt động sống của photoplase cũng 
bắt đầu việc tái tạo lại celluloza và khi vỏ celluloza đã được tái tạo thì tế bào mới được phân 
chia và tiếp tục phát triển.
 Qua vỏ celluloza, các muối khoáng và nước có thể trao đổi dễ dàng, tuy vậy đối với 
các đại phân tử như protein, nucleic axit thì vỏ celluloza cũng thể hiện 1 sự ngăn cách nhất 
định. DNA có thể xâm nhập tế bào qua cả vỏ celluloza lẫn màng nguyên sinh.
 Vỏ celluloza được hình thành không chỉ khi nằm trên cây hoàn chỉnh mà khi nuôi 
chúng riêng rẽ dưới dạng các tế bào đơn và trong trường hợp này nó mang hình thái rất đa 
dạng.
 Khi đã mất hẳn vỏ bọc celluloza, các protoplast luôn ở dạng tròn
 Lạp thể: bào quan đặc biệt của tế bào thực vật (tuy tế bào thực vật xanh)
 Lục lạp: lạp chứa và diệp lục (diệp lục là chất màu xanh lục)
 Bào quan: còn gọi cơ quan tử. Tế bào chất của tất cả tế bào nhân thực chứa một số cấu 
trúc có màng bao bọc, đảm nhiệm các chức năng chuyển hóa. Những cấu trúc này được gọi 
là bào quan.
 Ti thể: Bào quan của các tế bào nhân thật, có kích thước tương tự tế bào vi khuẩn mỗi 
tế bào có hơn 1.000 ti thể.
 - 1 - 
 (NMP)n + NTP (NMP)n +1 + Ppi 
 DNA polymeraza,MgH
 (NMP)n là đoạn RNA có sẵn gồm n nucleotide monophotphat NTP các nucleotit 
triphotphat (nucleotide)
 RNA polymeraza có khả năng nhận biết các điểm khởi đầu cho đọc mã trên chuỗi 
DNA
 Ở vi khuẩn các điểm này là các dãy mã TATA, còn gọi là “hộp TATA”, hộp TATA 
ở thực vật phức tạp hơn, được mã bằng nhiều nucleotit hơn, đa dạng hơn (vẫn gọi chung là 
hộp TATA), ví dụ :
 T - - - TATA - - - 1 - 3 - - - A 
 1 –3 : là số lần nhắc lại có thể có của ademin
 Ngoài hộp TATA, ở thực vật còn có hộp CAAT nằm ở phía thượng lưu của hộp 
TATA, hộp CAAT có nhiệm vụ điều hòa mức độ đọc mã. 
 1. RNA polymeraza I đọc mã cho sinh tổng hợp RNA ribosome (rRNA), chúng chỉ 
hoạt động bên trong nhân bào.
 2. RNA polymeraza II đọc mã cho sinh tổng hợp mRNA, hoạt động chủ yếu ở bên 
ngoài nhân bào
 3. RNA polymeraza III đọc mã cho sinh tổng hợp RNA ngắn như RNA vận chuyển 
(tRNA) hoặc hoặc tRNA 5S
 Mỗi tế bào thực vật chứa đến vài triệu ribosome, vì vậy ở các mô thực vật đang tăng 
trưởng mạnh đều có hoạt động sinh tổng hợp rRNA rất cao. Ở đây sản phẩm hoạt động của 
RNA polymeraza chưa tạo ngay ra các RNA hoàn chỉnh mà chỉ tạo ra các tiền chất của 
chúng. Các tiền chất này còn phải qua “cắt gọt” bằng metyl hóa còn lại kích thước cỡ 3000 – 
3500 nucleotit mới kết hợp với protein và tạo nên ribosome.
 Mỗi mRNA khác nhau, tương ứng với khoảng 100.000 gen. Mỗi mRNA đều có một 
dãy mã để tổng hợp protein, ngoài ra còn có thêm các dãy mã nằm ở 2 đầu để làm nhiệm vụ 
điều khiển quá trình dịch mã. Đầu 5 ’ của mRNA có một dãy mã ngắn gọi là mũ ở đầu 5 ’ (5’ 
cap). Mũ này thường là một gốc qua nosine), được chụp lên đầu 5 ’ của phân tử mRNA ngay 
sau khi RNA polymeraza II kết thúc quá trình đọc mã.Mã có nhiệm vụ bảo vệ mRNA hoặc 
ra lệnh cho quá trình tổng hợp protein khởi sự.
 Đầu 3’ của mRNA thường là 1 dãy mã độ 200 nucleotit toàn là gốc ademosinem gọi 
tên là đuôi poly A. Cũng như mã 5’, đuôi poly A được gắn vào mRNA ngay sau khi đọc mã, 
bằng E poly (A) polymerase.
 I.5.2. Dịch mã:
 Là quá trình sinh tổng hợp các phân tử protein căn cứ vào dãy mã trên phân tử 
mRNA. Như thể sự thể hiện gen có thể chia ra 2 mức, mức đọc và mức dịch.
 Để thấy rõ mức độ phức tạp của sự thể hiện một gen trong 100.000 gen của cây, hãy 
xem xét cấu trúc của gen mã hóa cho E polygalaclorunaza ở cà chua và sản phẩm thể hiện ở 
gen này.
 Trên gen mã hóa cho polygalaclorunaza có 8 dãy số. Kích thước từ 99 đến 953 
nucleotit. Hộp CAAT nằm ở nucleotit-31, thượng nguồn của tín hiệu bắt đầu đọc ATG. Quá 
trình đọc và dịch cho ra hai đoạn peptit 71 và 356 a.amin. Cuối cùng peptit 79 a.amin bị loại 
và hình thành phân tử E polygalaclorunaza có 356 a.amin
 - 3 - 
các ion Mg+ là yếu tố cần cho sự hoạt động của nucleotit phân huỷ DNA trong quá trình 
chiết. Protein được tách khỏi DNA bằng phenol hoặc chloroform
 Chiết suất DNA từ mô thực vật
 Lá nghiền với đệm chiết CATB có chứa mercabthoethamol. DNA được chiết bằng hỗn 
hợp cloroform izoamila, kết tủa bằng izphopanol, sau đó qua 1 số bước để rửa và tinh khiết 
DNA.
 Chiết xuất DNA thực vật để chạy PCR
 Mẫu lá được sử dụng ở lượng rất ít. Quá trình chiết được đơn giảm hóa nhiều để thao 
tác nhanh và làm cùng 1 lúc nhiều mẫu, tuy vậy DNA được chiết ra hoàn toàn đủ độ lớn và 
độ sạch để chạy PCR tiếp theo.
 I.2 Cắt DNA bằng Enzim giới hạn:
 * Các enzim giới hạn:
 Enzim giới hạn là nhóm endonucleoaza chỉ cắt phân tử DNA ở những vị trí có dãy mã 
nucleotit nhất định mà chúng có khả năng nhận ra. Thuộc tính rất quan trọng này của enzim 
giới hạn cho phép cắt phân tử DNA ở các vị trí chọn sẵn. Mỗi enzim giới hạn hoạt động tối 
thích trong các điều kiện khác nhau. 
 Ứng dụng chủ yếu của melylaza là để bảo vệ 1 số vị trí trên DNA mà người ta không 
muốn bị cắt bởi enzim giới hạn.
 I.3 Điện di DNA và các sản phẩm cắt DNA trên gel agaroze:
 Các đoạn DNA được cắt từ phân tử DNA có khối lượng khác nhau và diện tích khác 
nhau được tách ra khi di chuyển từ cực âm sang cực dương của máy điện di trong 1 điện 
trường có điện thế và cường độ thích hợp.
 I.4 Nối các đoạn bằng DNA ligase:
 DNA ligase là các enzim nối đoạn DNA lại với nhau. Điểm nối lại là đầu 3’ của một 
 ’
đoạn DNA và đầu 5 của đoạn còn lại. Năng lượng để nối là ATP 
 Ứng dụng quan trọng nhất của ligase là trong cấu trúc của các vector plasmid và các 
cấu trúc DNA khác đã có đủ các dãy mã cần thiết cho việc chuyển gen, biểu hiện gen, sàng 
lọc các tế bào đã chuyển gen.
 I.5. Dòng hóa gen:
 Dãy mã tự nucleotit của gen thường được biết thông qua tìm hiểu dãy mã tự axit 
amin của sản phẩm của nó, các protein. Sau khi chiết xuất, tinh sạch protein để giải mã, dãy 
mã tự axit amin của chúng
 *Nhân dòng gen:
 Nhân dòng gen là một tiến trình trong đó gen mục tiêu được định vị và nhân lên từ 
DNA được tách chiết từ một cá thể.
 Khi tách chiết DNA khỏi một cá thể thì tất cả gen của nó cũng được tách ra khỏi cá 
thể. DNA này chứa đến hàng ngàn gen khác nhau nên nhà di truyền học phải tìm ra gen 
 Ngân hàng gen:
 Bởi vì không thể định vị gen trên DNA bằng mắt thường, các nhà khoa học phải tạo 
ngân hàng gen.
 - 5 - 
 Thông tin di truyền acid deoxyribonucleic (DNA) tồn tại ở 3 dạng chính:
 - DNA của cơ thể bậc cao trong đó có DNA nhân và DNA cơ quan tử.
 - DNA của vi sinh vật.
 - DNA của plasmid.
 Biến nạp thông tin di truyền (chuyển gen) là kỹ thuật sử dụng DNA tinh khiết 
để đưa vào cơ thể hay tế bào khác và theo dõi biểu hiện của thông tin di truyền mới này.
 Để biến nạp hiệu quả nguyên liệu di truyền vào tế bào vật chủ, các cấu trúc di truyền 
cần được thiết kế thích hợp cho sự hợp nhất và biểu hiện của các gen ngoại lai. Cấu trúc di 
truyền phải mang một gen chỉ thị chọn lọc (selectable marker gen: gen mã hóa một protein 
khử độc của hóa chất bổ sung trong môi trường nuôi cấy, cho phép sinh trưởng ưu tiên của 
các tế bào có DNA ngoại lai được hợp nhất) hoặc sàng lọc (screenable marker gen: gen mã 
hóa một protein cho kết quả trong sản phẩm sống sót nhờ đó có thể xác định tế bào biến nạp 
thể hiện gen) để nhận biết hiệu quả biến nạp gen. 
 Một cấu trúc di truyền đặc trưng bao gồm: gen khởi đầu (promoter), gen mã hóa 
(coding gen) và gen kết thúc (terminator). Các gen mã hóa có thể được đưa vào mô thực vật 
nhờ vào các vector plasmid. Hai promoter chủ yếu thường được sử dụng cho biến nạp gen ở 
thực vật là: promoter CaMV 35S (cauliflower mosaic virus) thích hợp cho sự biểu hiện của 
DNA ngoại lai ở cây hai lá mầm và promoter ubiquitin của ngô thích hợp cho sự biểu hiện 
mạnh của DNA ngoại lai ở cây một lá mầm. 
 Các mẫu vật (các bộ phận của cây hoặc mô dùng để biến nạp) thích hợp nhất cho biến 
nạp gen là những mẫu vật đòi hỏi thời gian nuôi cấy trước và sau khi biến nạp ngắn nhất. 
Nhiều nghiên cứu cho thấy thời gian kéo dài của mô nuôi cấy thường tạo ra các đột biến di 
truyền làm mất khả năng tái sinh của các cây được biến nạp gen. Các mẫu vật được sử dụng 
trong chuyển gen thường là: protoplast, phôi non hoặc callus có nguồn gốc từ hạt (lúa mì), 
các mô nuôi cấy phát sinh cụm chồi, và trụ phôi (có nguồn gốc từ các hạt non hoặc hạt già) 
dùng để biến nạp trực tiếp DNA ngoại lai vào mô phân sinh ở cây hai lá mầm (legumes, 
bông...). Trong một số trường hợp, biến nạp thông qua nuôi cấy phát sinh phôi (embryogenic 
culture) cũng có thể thực hiện được, chẳng hạn ở các loài tùng bách, các loài cây ăn quả và 
một số loài khác.
 Công nghệ chuyển gen (biến nạp gen) thực hiện việc chuyển các gen ngoại lai vào tế 
bào và mô thực vật. Có nhiều phương pháp chuyển gen khác nhau ở thực vật, nhưng ở đây 
chỉ trình bày một số phương pháp chủ yếu:
 II.1. Agrobacterium:
 Agrobacterium tumefaciens và Agrobacterium rhizogenes là hai loài vi khuẩn gây 
bệnh cho thực vật được sử dụng như các vector tự nhiên để mang các gen ngoại lai vào mô 
và tế bào thực vật. A. tumefaciens có chứa một plasmid lớn kích thước khoảng 200 kb gọi là 
Ti-plasmid (tumor inducing plasmid) chính là tác nhân truyền bệnh cho cây. Khi cây bị 
nhiễm A. tumefaciens qua các vết thương, biểu hiện bệnh rõ nhất là các khối u được hình 
thành ở ngay chỗ lây nhiễm. Sự hình thành khối u sau đó có thể tiếp tục mà không cần thiết 
phải có sự hiện diện của vi khuẩn. Khả năng này có được do A. tumefaciens đã chuyển một 
đoạn DNA của Ti-plasmid (T-DNA) xâm nhập vào hệ gen của cây bị bệnh.
 - 7 - 
 Hình 2.4.Qui trình chuyển gen bằng Agrobacterium tumefaciens
 II.3. T-DNA:
 T-DNA được nghiên cứu rất kỹ. Đó là một đoạn DNA có kích thước 25 kb trong đó 
chứa gen mã hóa cho sinh tổng hợp auxin, cytokinin, opine và các gen gây khối u 
(oncogenes). Trong Ti-plasmid, vị trí của T-DNA được giới hạn bằng RB và LB. Ngoài T-
DNA, trên Ti-plasmid còn có các vùng DNA mã hóa cho việc tái sinh plasmid (replication), 
cho khả năng lây nhiễm và tiếp hợp (vùng vir), cho việc tiêu hóa opine (opine catabolism) 
 Trong các vùng DNA của Ti-plasmid, ngoài T-DNA, được nghiên cứu nhiều hơn cả là 
vùng DNA phụ trách khả năng lây nhiễm còn gọi là vùng vir. Sản phẩm hoạt động của các 
gen nằm trong vùng vir dưới tác động kích thích của các hợp chất phenol tiết ra từ vết 
thương là một loạt các protein đặc hiệu như virE2, virB, virD, virD2, virC1... Các protein 
này nhận biết các vết thương ở các cây chủ thích hợp (hầu hết là cây hai lá mầm), kích thích 
sản sinh ra các đoạn T-DNA, bao bọc che chở các đoạn DNA này và giúp chúng tiếp cận với 
hệ gen của cây chủ một cách an toàn.
 Khi cây nhiễm A. tumefaciens, do T-DNA nạp vào trong hệ gen của cây chủ bắt đầu 
hoạt động và sản sinh ra auxin, cytokinin và opine, toàn bộ sinh trưởng của cây bị rối loạn, 
các tế bào phân chia vô tổ chức và tạo ra các khối u. Opine được vi khuẩn sử dụng như một 
loại “thức ăn”. Nhờ gen chuyển hóa opine trên Ti-plasmid. Cơ chế lây nhiễm của A. 
rhizogenes đối với cây hai lá mầm cũng tương tự, nhưng trong vùng T-DNA của A. 
rhizogenes chỉ có gen sản sinh ra auxin, vì thế sự thay đổi hình thái chính của thực vật là 
chúng tạo ra rất nhiều rễ tơ (hairy roots) khi bị nhiễm bệnh.
 - 9 -