Sáng kiến kinh nghiệm Những phương pháp chuyển gen và kết quả đạt đựơc trong lĩnh vực tạo động vật chuyển gen

I. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI 
 Để cải tiến tiềm năng di truyền của cây trồng, vật nuôi...nhằm nâng cao 
năng suất, hiệu quả sản xuất nông nghiệp con người đã tiến hành quá trình 
chọn giống và nhân giống. Phương pháp lai tạo và chọn lọc cổ truyền để cải 
tạo nguồn gen của sinh vật còn nhiều hạn chế. Gần đây, công nghệ chuyển 
gen ra đời đã cho phép khắc phục những hạn chế của phương pháp lai tạo và 
chọn lọc cổ truyền. Nó cho phép chỉ đưa những gen mong muốn vào động 
vật, thực vật...để tạo ra những giống vật nuôi, cây trồng mới..., kể cả việc 
đưa gen từ giống này sang giống khác, đưa gen của loài này vào loài khác. 
 Trước đây, việc chuyển gen được làm trực tiếp bằng cách bắn (vi tiêm), 
nhưng phương pháp này không khống chế được số lượng gen, và các gen đi 
vào sinh vật không bền vững, không gắn với nhiễm sắc thể của sinh vật nên 
có thể bị mất đi tính trạng. Hiện nay, chúng ta dùng các phương pháp hiện 
đại hơn để đưa gen cần bổ sung vào thực, động vật, tạo cho chúng đặc tính 
mới. Chọn phương pháp chuyển gen phụ thuộc vào mức độ biểu hiện được 
mong đợi, biểu hiện trong thời gian ngắn, hoặc biểu hiện ổn 
định loại tế bào đích. 
 Công nghệ chuyển gen động vật đã thành công trên nhiều loài động vật 
như thỏ, lợn, cừu, dê, bò, gà, cá ....Sinh vật biến đổi gen so với sinh vật 
thường chúng có những đặc tính ưu việt hơn: tạo ra động vật có sức chống 
chịu tốt (chống chịu bệnh tật, sự thay đổi của điều kiện môi trường...); các 
vật nuôi có tốc độ lớn nhanh, hiệu suất sử dụng thức ăn cao, cho năng suất 
cao và chất lượng sản phẩm tốt; nhiều loài động vật mang những gen mong 
muốn phục vụ cho những mục đích nhất định 
 Để làm rõ vấn đề trên chúng tôi chọn đề tài “Những phương pháp 
chuyển gen và kết quả đạt đựơc trong lĩnh vực tạo động vật chuyển gen” 
 PHẦN II. NỘI DUNG 
 2 hợp DNA-polycation do sự đóng góp của polycation, cho phép phức hợp 
này đi đến kết hợp chặt chẽ hơn với màng tế bào tích điện âm. Sự xâm nhập 
của phức hợp có thể đạt được nhờ sự nhập bào 
 Hình 1. Phức hợp DNA-calcium phosphat 
 Hình 2. Sự kết hợp giữa DEAE-dextran và DNA 
2. Phương pháp lipofection 
 Sử dụng các lipid trung tính hoặc cation để tạo thành liposome. Phức 
lipid hợp nhất với màng huyết tương sẽ phóng thích DNA dính bám vào 
trong phần bào tan. Tính đồng nhất của thành phần lipid giữa màng tế bào 
vật chủ và lipofectant làm tăng hiệu quả dung hợp và tăng khả năng xâm 
 4 bào tan. Phương pháp này được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy dịch huyền 
phù lynphocyte. 
 Chuyển nạp gen bằng xung điện có khuynh hướng tạo ra các thể hội 
nhập mang bản sao DNA đơn và thường được sử dụng để chuyển gen vào 
các tế bào mầm phôi. Việc chuyển nạp gen thông qua điện trường ở các tế 
bào máu và các thế hệ tổ tiên của chúng là phương thức thích hợp cho các 
viral vector cần hệ thống đóng gói phức tạp. 
 Hình 4. Hệ thống chuyển gen bằng xung điện 
4. Phương pháp vi tiêm 
 - Đây là phương pháp chuyển DNA trực tiếp nhất và có hiệu quả cao. 
Tiến bộ lớn nhất của phương pháp vi tiêm là khả năng giám sát biệu hiện 
của DNA ngoại lai ở các tế bào riêng lẻ. 
 - Nguyên tắc của phương pháp vi tiêm là một lượng nhỏ DNA được 
tiêm trực tiếp vào nhân tế bào phôi trần hoặc tế bào nguyên vẹn một cách cơ 
học dưới kính hiển vi. Phương pháp này cho phép đưa gen vào đúng vị trí 
mong muốn ở từng tế bào với hiệu quả tương đối cao.Tuy nhiên do đòi hỏi 
phải tinh vi, tỉ mỉ và cực kỳ chính xác nên hạn chế số lượng tế bào vi tiêm và 
ngoài ra còn có thể làm tổn thương đến tế bào phôi do tác nhân cơ học gây 
ra khi tiến hành vi tiêm. 
 - Đặc trưng của phương pháp vi tiêm là cung cấp phương thức để tạo ra 
 6 
 Hình 6. Phương thức tạo bò chuyển gen bằng vi tiêm DNA 
5. Phương pháp dùng súng bắn gen 
 - Phương pháp này sử dụng đạn là các hạt kim loại nặng cơ bản được 
bao bọc DNA. Mặc dù có nhiều thiết kế kỹ thuật khác nhau nhưng nguyên lý 
chung của phương pháp này là sử dụng áp lực xung của khí helium để tăng 
tốc các hạt. 
 - Súng bắn gen bao gồm hai buồng bằng thép không gỉ, kích thước 
6“x7“x10“ nối với hai bơm chân không. DNA ngoại lai được gắn vào các 
hạt tungsten có đường kính rất nhỏ, khoảng 1μm. Các hạt này được đặt trên 
một cái đĩa ở mặt bên trong của súng. Sự bùng nổ khí helium ở 1000psi làm 
cho cái đĩa bắn về phía trước với tốc độ 1300 foot/s, tương đương với tốc độ 
khi một viên đạn rời khỏi nòng súng. 
 - Phương pháp này có ưu điểm là thao tác dễ dàng, có thể chuyển gen 
vào nhiều loại tế bào và mô, các tế bào được biến nạp có tỉ lệ sống sót cao, 
cho phép đưa các gen vào tế bào ở vị trí mong muốn....Do vậy nó được sử 
dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. 
 8 vào hệ gen của vật chủ nhưng virus sử dụng phải là virus an toàn, không gây 
bệnh. 
 Hình 8. Chuyển gen nhờ vector là virus 
7. Chuyển gen bằng cách sử dụng tế bào gốc phôi 
 Từ các túi phôi nuôi cấy in vitro, người ta đã tiến hành tách chiết các tế 
bào gốc phôi và biến nạp gen ngoại lai vào những tế bào này. Sau khi chọn 
ra những tế bào đã được biến nạp gen lạ người ta đưa nó vào phôi khác ở 
giai đoạn phôi nang để tạo ra động vật chuyển gen thể khảm. Trên 30% động 
 10 Hình 9. Sơ đồ cấu trúc gen chuyển biểu hiện 
 Enhancer: trình tự tăng cường SIG: trình tự tín hiệu 
 ATG: vị trí khởi đầu phiên mã AAA: đuôi polyA 
2. Tạo cơ sở vật liệu biến nạp gen 
 Ở động vật có vú giai đoạn biến nạp gen thích hợp nhất là trứng ở giai 
đoạn tiền nhân (pronucleus), giai đoạn mà nhân của tinh trùng và trứng chưa 
dung hợp (fusion) với nhau. Ở giai đoạn này tổ hợp gen lạ có cơ hội xâm 
nhập vào genome của động vật nhờ sự tái tổ hợp DNA của tinh trùng và của 
trứng. Do tế bào phôi chưa phân chia và phân hoá nên tổ hợp gen lạ được 
biến nạp vào giai đoạn này sẽ có mặt ở tất cả các tế bào kể cả tế bào sinh sản 
của động vật trưởng thành sau này. Trứng chín được thu nhận bằng phương 
pháp sử dụng kích dục tố theo chương trình đã được xây dựng cho mỗi loài 
hoặc bằng phương pháp nuôi cấy trứng trong ống nghiệm. Sau đó thụ tinh 
nhân tạo để tạo ra trứng tiền nhân. Ðể tạo ra một động vật chuyển gen, yêu 
cầu cần phải sử dụng hàng trăm thậm chí hàng ngàn trứng thụ tinh. 
3. Chuyển gen vào động vật 
 Việc đạt được mục đích của việc tạo ra động vật chuyển gen đòi hỏi sự 
phát triển của các phương pháp có hiệu quả để chuyển gen mong muốn vào 
phôi. Hiện nay có nhiều phương pháp chuyển gen khác nhau đang được sử 
dụng để tạo động vật chuyển gen: vi tiêm, chuyển gen bằng cách sử dụng 
các tế bào gốc phôi, chuyển gen bằng cách sử dụng vector virus... 
 4. Nuôi cấy phôi trong ống nghiệm 
 Đối với động vật bậc cao, tế bào trứng tiền nhân sau khi vi tiêm được 
nuôi cấy trong ống nghiệm để phát triển đến giai đoạn phôi dâu (morula) 
hoặc túi phôi. Ở giai đoạn này màng trong (pellucida) bị bong ra và phôi có 
thể làm tổ được ở dạ con. Những phôi này được cấy chuyển vào con nhận đã 
 12 III. Kết quả đạt đựơc trong lĩnh vực tạo động vật chuyển gen 
1. Chuột chuyển gen 
 Vào năm 1982, Palmiter và Brinster đã thành công trong việc tạo ra 
động vật chuyển gen đầu tiên trên thế giới, bằng cách chuyển gen của loài 
chuột này sang phôi loài chuột khác. Gen chuyển đã biểu hiện ở chuột 
chuyển gen và các thế hệ con cháu của chúng. Việc chuyển một gen ngoại 
lai vào trứng chuột thụ tinh. Sau đó cấy các trứng này vào chuột mẹ thay thế 
và đã chứng minh được rằng gen chuyển hoạt động chức năng trong một số 
chuột con sinh ra. Nhân giống chuột thế hệ con, các nhà khoa học đã cho 
thấy gen chuyển có thể được truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác theo qui 
luật di truyền Mendel. Chuột chuyển gen được tạo ra là một định hướng 
quan trọng trong nghiên cứu liệu pháp gen để điều trị các rối loạn gây nên 
bởi các lỗi của mã di truyền. Palmiter và Brinster đã hiểu được cơ chế tế bào 
đọc mã di truyền và dịch các thông tin đó thành các cấu trúc sinh học. Chuột 
chuyển gen đã cung cấp cho Palmiter và Brinster phương pháp để kiểm tra 
các mô hình thí nghiệm và điều trị bệnh. 
 Hình 11. Chuột chuyển gen horrmone sinh trưởng (bên phải) 
 và chuột đối chứng (bên trái) 
 Ngày nay các nghiên cứu chuột chuyển gen đã góp phần cung cấp các 
hiểu biết về sự điều hòa hoạt động của gen, sự phát triển khối u, tính đặc 
hiệu của miễn dịch, di truyền học phân tử của sự phát triển và các quá trình 
 14 gia Mỹ; các nhà khoa học thuộc trường Ðại học Louisiana và Trường Y 
khoa Tufts đã dẫn đến thành công là tạo ra ba dê cái chuyển gen mạnh khoẻ. 
Kết quả này được công bố vào tháng 5 năm 1999. Các dê cái này mang gen 
antithrombin III (AT III) của người và là động vật đầu tiên biểu hiện protein 
này trong sữa của nó. AT III là một protein ở trong plasma, có vai trò điều 
hoà quá trình đông máu. Hiện nay trong điều trị bệnh, AT III là chất chống 
đông máu hiệu quả ở các bệnh nhân trải qua phẫu thuật tim chọn lọc. Ba dê 
cái này được tạo ra từ cùng một bố mẹ hoàn toàn bình thường. Trước tiên 
gen AT III được gắn với một promotor thích hợp và tiêm tổ hợp này vào 
nhân của trứng mới thụ tinh. Trong một số trường hợp, gen của người đã 
tích hợp vào DNA phôi dê. Sau khi loại bỏ nhân của các tế bào trứng nhận, 
các nhà nghiên cứu đã hoạt hoá và dung hợp các trứng không nhân này với 
các nguyên bào sợi có nguồn gốc từ thai dê cái chuyển gen ATIII bằng cách 
sử dụng một xung điện. Phôi tạo thành được chuyển ghép vào dê mẹ mang 
chữa hộ. Các dê cái thế hệ con sẽ cho sữa mang protein người. Protein này 
sẽ được tách chiết để sử dụng cho việc chữa bệnh. Mặt khác, 50% dê cái 
được sinh ra bởi các thế hệ tiếp theo của các dê cái nói trên cũng sẽ tạo ra 
AT III. 
3. Lợn chuyển gen 
 Khác với chuột, các hợp tử của lợn phải được ly tâm để nhìn thấy tiền 
nhân. Sau khi ly tâm, khoảng 50% hợp tử phát triển in vivo đến giai đoạn 
phôi dâu (morula) hoặc phôi nang (blastocyst). Các hợp tử vi tiêm, 10 - 20% 
phát triển đến các giai đoạn phôi khác nhau. Trong số các hợp tử vi tiêm thì 
5,6 - 11% số hợp tử đã phát triển và tạo thành lợn con. Tỉ lệ hợp nhất gen 
ngoại lai vào DNA của con chủ là khoảng 10%. Các gen hormone sinh 
trưởng sử dụng trong các thí nghiệm đầu tiên đã cho tỉ lệ biểu hiện 50%. Sự 
di truyền Mendel đơn giản đã được chứng minh với các dòng tế bào mầm 
được chuyển gen. Mức độ biểu hiện được duy trì trong những lần sinh sản 
tiếp theo. 
 Các nhà khoa học Hàn Quốc vừa nhân bản thành công một con lợn 
mang gen người. Đây là một bước tiến lớn trong nỗ lực cấy ghép nội tạng 
 16 ghép hợp tử là thấp hơn đáng kể so với các phôi đối chứng. Hiện nay thỏ là 
đối tượng chuyển gen nhằm mục đích tạo ra protein quí sử dụng trong y 
dược thông qua tuyến sữa bởi các lý do sau đây: 
 - Giá phôi thỏ thấp nên có thể tạo ra một lượng lớn thỏ chuyển gen. 
 - Thời gian mang thai của thỏ ngắn và thành thục sinh dục nhanh 
 - Giá sản xuất thấp. 
 - Về mặt di truyền, thỏ gần với người hơn bất kỳ động vật cho sữa nào 
khác do vậy nó là mô hình được chọn cho việc sản xuất các protein chữa 
bệnh ở người đặc biệt là các protein phức tạp. 
 - Không truyền các bệnh nghiệm trọng do virus gây ra cho người. 
 Lượng protein tái tổ hợp trong sữa thỏ chuyển gen biến đổi từ 1-10g 
trong một lít. Các loại protein có thể được sản xuất trong sữa thỏ là các 
kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody), vaccin... Vào năm 2001, 
Eduardo Kac, giáo sư thuộc Học viện Nghệ thuật Chicago, Mỹ đã kết hợp 
với các nhà Di truyền học Pháp đã tạo một con thỏ chuyển gen có khả năng 
phát ra ánh sáng màu lục ở trong tối bằng cách vi tiêm gen mã hoá protein 
huỳnh quang màu lục có nguồn gốc từ sứa vào hợp tử thỏ. 
 Hình 14. Thỏ chuyển gen protein huỳnh quang màu lục 
5. Chó chuyển gen 
 Trước đó các nhà khoa học tại Nhật, Mỹ và châu Âu từng nhân bản 
chuột, mèo và lợn phát sáng. Năm 2007 các nhà khoa học Hàn Quốc lần đầu 
 18